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博士生预答辩报告公示-曹菲 201411210105

发布时间:2019-08-29 16:34:23 浏览量:441

报告题目:维甲酸诱导心肌致密化不全的基础研究

报告概况:

本课题研究了维甲酸 (retinoic acid,RA)诱导心肌致密化不全(non-compaction of ventricular myocardium,NVM)的基础研究方面的一些基本问题,包括探讨如何运用维甲酸诱导心肌致密化不全建立小鼠模型。在成功建立NVM小鼠模型后,运用TMT标记定量蛋白质组学检测NVM心脏组织相关蛋白,以及运用靶向PRM蛋白质绝对定量对NVM差异蛋白验证,进而发现一些潜在的与NVM相关蛋白,为后续的蛋白功能验证、探索NVM相关发病机制及靶向治疗的可能性提供了基础研究平台。

首先根据先前关于精确浓度RA与正常胚胎心肌致密化发育过程密切相关的研究报告,提出了采用腹腔灌注过量全反式维甲酸(ATRA)干扰孕鼠胚胎心肌致密化过程,从而诱导出生后幼鼠建立NVM模型的设想。其方法如下:将孕鼠分为3组:空白对照组、DMSO对照组和RA干预组。妊娠后8.5天给予溶解于DMSO 70 mg/kg ATRA诱导RA干预组小鼠胚胎致密化不全,建立NVM模型。孕鼠分娩后即处死的新生小鼠,获取幼鼠心脏石蜡包埋并垂直于心脏长轴,以心脏短轴为切面,从心尖开始进行病理切片。HE染色在40倍和100倍放大下观察心尖、瓣膜前及瓣膜水平等不同切面的病理变化。典型的NVM病理诊断标准为:心肌由两层增厚的心室心肌壁组成:分别为薄而致密的心外膜层和具有数个显著突出肌小梁和深凹的隐窝与心室相通而形成极厚的心内膜层,且非致密层(N)与致密心肌层(C)的厚度比N/C>1.4。采用单因素方差分析(ANOVA)和两组最小显著性差异(LSD)多重比较分析三组的差异,P值<0.05为显著。显微镜下组织病理学观察显示:与空白对照组(n=20)和DMSO对照组(n=15)相比,RA干预组(n=17)孕鼠子代表现出典型的NVM组织病理学特征:均表现出明显薄弱的致密层和较厚的非致密层。ATRA干预后组左心室N/C比值为2.735±1.634,显著高于DMSO对照组0.178±0.119和空白对照组0.195±0.118,差异有统计学意义(F=32.550,P值<0.0001);RA干预后组右心室N/C比值为(6.068±4.394),也显著高于DMSO对照组为0.459±0.24,空白对照组为0.248±0.182,有显著性差异(F=20.069,p <0.0001)。左右心室的N/C比值在LSD两组间多重比较显示RA干扰组与空白对照组(P<0.0001)、RA干扰组与DMSO对照组(P<0.0001)之间均有有显著性差异。空白对照组与DMSO对照组的N/C比值分别在左室(P=0.963)和右室(P=0.848)均无显著性差异。结论:过量的ATRA可诱导胎鼠心脏NVM。该动物模型可为下一步TMT标记定量蛋白质组学NVM心脏组织检测奠定基础。

随后在RA导孕鼠子代心肌发生非致密化建立NVM幼鼠模型后,大家运用TMT标记定量蛋白质组学技术开展RA诱导NVM的基础研究,在Mus musculus (mouse)中共鉴定到蛋白质5444个。按照表达倍数变化 1.2 倍以上(上调大于 1.2 倍或者下调小于 0.83 倍)且 P value<0.05 的标准筛选差异表达蛋白质。其中,RA_vs_Control组的上调差异表达蛋白质有38个,下调差异表达蛋白质30个,总调节差异蛋白68个;RA_vs_DMSO组的上调差异表达蛋白质有23个,下调差异表达蛋白质25个,总调节差异蛋白48个;经过 GO 功能和 KEGG 通路分析发现,这些差异表达蛋白质的功能主要是blood coagulation、fibrin clot formation,negative regulation of hemostasis,negative regulation of coagulation,negative regulation of blood coagulation,protein activation cascade,regulation of heterotypic cell?cell adhesion,fibrinolysis,negative regulation of cell adhesion molecule production等重要生物学过程,trivalent inorganic cation transmembrane transporter activity,ferric iron transmembrane transporter activity,brain?derived neurotrophic factor binding,neurotrophin binding,iron ion transmembrane transporter activity,growth factor binding等分子功能,cell surface,extracellular space,extracellular region,extracellular region part,external side of plasma membrane,HFE?transferrin receptor complex等定位蛋白质,发生了显著性变化。该蛋白组学检测可为下一步靶向PRM蛋白质绝对定量对NVM差异蛋白验证奠定基础。

最后在TMT标记定量蛋白质组学检测NVM心脏组织检测结构分析之后,运用靶向PRM蛋白质绝对定量对NVM差异蛋白验证。经过预实验和正式实验后对分别对Control、DMSO以及RA三组9例幼鼠心脏样品中O08677、P55088、Q00623、Q00898、Q01339及Q9D6F9 6种目标蛋白的12条肽段进行LC-PRM/MS定量分析,采用同位素重标肽段对定量信息进行归一化校正,进而对目标肽段和目标蛋白进行相对定量分析。分析结果表明:在3种不同条件下,6种目标蛋白的表达量存在一定的差异。这为后续的NVM相关蛋白功能验证,了解NVM相关发病机制及靶向治疗提供了基础研究平台。

答辩评委:饶莉,杨正林,刘贻尧,蒋黎,尹立雪

报告人:曹菲 2014级博士 201411210105

报告时间:2019年9月3日

报告地点:四川省医学科学院·四川省人民医院心超科

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